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Rehnolt, C.
Etablierung von Methoden zur Erhebung von Daten über das Altern hämatopoetischer Stammzellen in einem Langzeitexpansionsmodell
[ Diplomarbeit ] Medical University of Graz; 2012. pp. 98
[OPEN ACCESS]
FullText
- Authors Med Uni Graz:
- Advisor:
- Schwinger Wolfgang
- Stelzer Ingeborg
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- Abstract:
- Hämatopoetische Stammzellen (HSC)-Transplantationen zeigen heutzutage gute Erfolge. Es blei-ben jedoch Fragen offen. So ist noch nicht geklärt, ob ein größerer Altersunterschied zwischen Spender und Empfänger zu einem Erschöpfen der Stammzellfunktion der transplantierten HSC führt. Es ist bereits bekannt, dass es bei der ex vivo Kultur zu einem vermehrten Ausreifen der Zellen, einer Störung des Homing, häufigerer Apoptose und zu einer Initiierung des Zellzyklus kommt. Das hat zur Folge, dass die Quieszenz gestört wird, sich das blutbildende System schneller er-schöpft, und dass eine Alterung der Stammzellen eintritt. Mit anderen Worten ¿ die Zellen zeigen ex vivo eine frühe Seneszenz. Dieser Aspekt wird ausgenutzt, um die Mechanismen, die in vivo Jahrzehnte dauern würden, in vitro in kürzerer Zeit zu untersuchen. Diese Arbeit beschäftigt sich mit den Mechanismen des Alterns bzw. der Vorgänge bei einer 25-wöchigen stromafreien ex vivo Kultur von HSC. Sie hilft bei der Etablierung von Methoden zur weiteren Untersuchung von Alterung bzw. ex vivo Expansion von HSC. Wöchentlich wurden folgende Parameter untersucht: Die Teilungsfähigkeit und Differenzierung wurde mittels Durchflusszytometrie und CASY bestimmt. Für die Bestimmung des Senescence Evasion Factor, der Telomerlänge und der Cycline C, D1, D3, E, A und B1 wurden qRT-PCRs durchgeführt. DNA-Schäden wurden mittels alkalischem Comet-Assay untersucht. Die Messung des oxidativer Stresses erfolgte durch Bestimmung der carbonylierten Proteine. Rückschlüsse auf ein self-renewal wurden indirekt durch den CFU-GM-replating Assay gezogen und die Telomera-seaktivität wurde mit Hilfe des TRAP-Assay untersucht. Die Zellkultur zeigte eine Vermehrung der HSC um den Faktor 105,9 bei einer Gesamtzellvermeh-rung von 106,7. SNEV zusammen mit den Cyclinen deuten darauf hin, dass es in bestimmten Phasen der Kultur zu einem Arrest des Zellzyklus kam. Aus dem Verlauf des Comet-Scores lässt sich ableiten, dass die HSC in der Lage sind, DNA-Schäden bis zu einem bestimmten Punkt zu reparieren, aber danach die Schäden konstant zunehmen. Die Telomeraseaktivität als auch die Telomerlänge bleiben bis zu einem bestimmten Punkt relativ konstant und fallen anschließend ab. Interessanterweise kam es bei Passage 17 zu einem starken Anstieg der Telomeraseaktivität, be-gleitet von einer Verlängerung der Telomere. Zusätzlich finden sich Hinweise, die für einen möglichen Zellzyklusarrest in derselben Passage sprechen könnten.